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Analyse de la réplication du génome humain par séquençage nanopore (Document en Français)

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Modalités de diffusion de la thèse :

Thèse consultable sur internet, en texte intégral.

Informations sur les contributeurs

Auteur : Rojat Victoria

Rojat, Victoria

Nom

Rojat

Prénom

Victoria

Nationalité

Date de soutenance : 21-03-2025

Directeur(s) de thèse : Le Tallec Benoît

Le Tallec, Benoît

Nom

Le Tallec

Prénom

Benoît

- Ciardo Diletta

Ciardo, Diletta

Nom

Ciardo

Prénom

Diletta

Etablissement de soutenance : Université Paris sciences et lettres

Université Paris sciences et lettres

Nom

Université Paris sciences et lettres

Laboratoire : Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)

Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)

Nom

Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)

Ecole doctorale : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)

École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)

Nom

École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)

Informations générales

Discipline : Génétique et génomique
Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie

Mots-clés libres : Réplication de l'ADN, Stress réplicatif, Séquençage nanopore, Molécule unique
Mots-clés :

Génétique
Génomique

Résumé : Chez les eucaryotes, la réplication de l’ADN commence à partir de multiples origines activées en phase S. Chaque origine forme deux fourches de réplication divergentes qui synthétisent l'ADN. La localisation des origines dans le génome humain reste incertaine, et les facteurs qui régulent la progression des fourches sont eux aussi mal connus. Pour y remédier, notre laboratoire a développé FORK-seq, une méthode de cartographie de la réplication en molécule unique, à haut débit et à haute résolution basée sur la détection par séquençage nanopore d’un analogue de la thymidine, le bromodésoxyuridine (BrdU), incorporé pendant la réplication. FORK-seq a été utilisée avec succès chez la levure S. cerevisiae mais transposer cette approche chez l’Homme est un défi majeur car la taille du génome humain, 250 fois celle du génome de levure, décuple les coûts de séquençage et rend indispensable une stratégie d’enrichissement en signaux BrdU. J’ai donc conçu un protocole de marquage spécifique, le « multi-pulse », qui consiste à marquer les cellules avec des pulses successifs de BrdU pour démultiplier les signaux réplicatifs. En plus d’accroître le nombre de fourches détectées, le « multi-pulse » donne également accès à leur vitesse en divisant simplement la distance parcourue par une fourche par l’intervalle de temps séparant deux pulses. Les lectures nanopores les plus longues offrent même l’opportunité de suivre les fourches pendant plusieurs heures, et de voir le programme de réplication se dérouler sous nos yeux. Grâce à cette méthode, j’ai réalisé dans les cellules HCT116 la première carte réplicative du génome humain en molécule unique, positionnant plusieurs millions de fourches individuelles ainsi que des centaines de milliers d’évènements d’initiation et de terminaison. Deux pulses successifs de BrdU suffisant à estimer la vitesse des fourches de réplication, j’ai aussi mis au point le « double-pulse », ersatz simple et rapide du « multi-pulse » permettant de suivre la progression des fourches et de détecter leur ralentissement en présence de stress réplicatif.

Informations techniques

Type de contenu : Text
Format : PDF

Informations complémentaires

Entrepôt d'origine :

STAR : dépôt national des thèses électroniques françaises

Identifiant : 2025UPSLE003
Type de ressource : Thèse

Fiche descriptive