Assas Recherche | Caractérisation du système CRISPR/Cas9 et amélioration de l’édition de génome pour la génération d’iPS humaines et de rats génétiquement modifiés

Caractérisation du système CRISPR/Cas9 et amélioration de l’édition de génome pour la génération d’iPS humaines et de rats génétiquement modifiés (Document en Français)

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Modalités de diffusion de la thèse :

Thèse consultable sur internet, en texte intégral.

Informations sur les contributeurs

Auteur : Chenouard Vanessa

Chenouard, Vanessa

Nom

Chenouard

Prénom

Vanessa

Nationalité

Français

Date de soutenance : 02-12-2021

Directeur(s) de thèse : Anegon Ignacio

Anegon, Ignacio

Nom

Anegon

Prénom

Ignacio

- Cherifi Yacine

Cherifi, Yacine

Nom

Cherifi

Prénom

Yacine

Etablissement de soutenance : Nantes

Nantes

Nom

Nantes

Laboratoire : @Center for Research in Transplantation and Translational Immunology

@Center for Research in Transplantation and Translational Immunology

Nom

@Center for Research in Transplantation and Translational Immunology

Ecole doctorale : École doctorale Biologie-Santé (Nantes)

École doctorale Biologie-Santé (Nantes)

Nom

École doctorale Biologie-Santé (Nantes)

Informations générales

Discipline : Biologie moléculaire et structurale, Biochimie
Classification : Médecine et santé

Mots-clés libres : ...
Mots-clés :

Mutation (biologie)
CRISPR-Cas9
Transgénose - Rats

Résumé : CRISPR/Cas9 a révolutionné l’édition de génome en l’élargissant à des espèces animales et des types cellulaires variés. Les nombreuses études sur CRISPR permettent une bonne compréhension générale du système (études cristallographiques, enzymatiques et mécanistiques…). Toutefois, il reste encore de nombreux aspects à étudier pour une meilleure maîtrise de l’édition de génome et une meilleure efficacité de génération de modèles génétiquement modifiés, même pour les plus complexes. Ces derniers nécessitent l’insertion d’une large séquence ADN (cassette d’expression, gène rapporteur, système conditionnel…) ou plusieurs séquences contenant une structure particulièrement complexe (double insertion de sites loxP flanquant un exon…) qui diminuent fortement l’efficacité de recombinaison homologue requise pour leur génération. J’ai donc caractérisé la base moléculaire du système CRISPR/Cas9. En particulier, j’ai étudié la formation du complexe RNP par différentes techniques notamment la « Nano Differential Scanning Fluorimetry » et sa fonctionnalité clivage in vitro. Ces études m’ont permises de démontrer que, dans des conditions optimales de formation de ce complexe (tampon, Cas9, guide ARN…), un ratio Cas9 protéine /dual guide ARN 1/1 est suffisant. J’ai donc appliqué ce principe aux cellules iPS humaines et embryons de rats pour confirmer ces résultats et déterminer in vivo les concentrations optimales de Cas9 et court donneur ADN afin d’obtenir les meilleurs taux d’insertion d’une courte séquence simples. Cette preuve de concept nous a permis d’obtenir plus de 50% de succès dans les deux modèles utilisés. En parallèle, nous avons tenté deux approches d’import d’un donneur ADN via le guide ARN qui ne nous ont pas permis d’améliorer la génération de nos modèles mais d’autres stratégies de ce type sont en cours. L’ensemble de ces résultats permettra un emploi de CRISPR/Cas9 plus maîtrisée et ouvre la voie à une réflexion sur l’optimisation de l’utilisation des longs donneurs ADN pour la génération de modèles complexes de façons plus efficaces et maîtrisé.

Informations techniques

Type de contenu : Text
Format : PDF

Informations complémentaires

Entrepôt d'origine :

STAR : dépôt national des thèses électroniques françaises

Identifiant : 2021NANT1047
Type de ressource : Thèse